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ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN
CELULAR
La técnica del ADN
recombinante se utiliza en estudios sobre la
regulación de la expresión génica, en la
regulación de la producción comercial de síntesis
de proteínas como la Insulina o la hormona del
crecimiento, en el desarrollo de organismos
transgénicos y en la amplificación del ADN, es
decir, en obtener un gran número de copias de un
gen determinado. En este último caso, existe una
técnica mejor, denominada con las siglas
PCR.
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Preparación de la secuencia del ADN para su
clonación
Es la parte
esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse
y concentrarse.
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Partimos de células
con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).
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Las proteínas
estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares
deben separarse del ADN.
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El ADN obtenido se
concentra y se fragmenta por acción de las
enzimas de restricción.
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Se aísla el ADN que
se desea clonar, por ejemplo, mediante
cromatografía líquida o por centrifugación.
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Si el ADN debe
expresarse hay que añadir los segmentos
reguladores de la expresión génica.
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Preparación de un vector de clonación
El vector es el
portador de la secuencia de ADN que se desea
clonar. Un vector debe presentar las siguientes
características:
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Una pequeña
secuencia de ADN fácil de aislar, como, por
ejemplo, un plásmido.
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Contener distintos
puntos de ataque a
enzimas de restricción
y que sean conocidos.
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Poder ser incluido
en la
célula anfitriona
con facilidad.
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Replicarse de forma
independiente al ADN de la célula anfitriona.
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Poseer un gen
marcador con el que puedan identificarse y
seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de
marcador puede ser la resistencia a un
antibiótico.
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Las etapas del
proceso consisten en:
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Cortar el vector
con
enzimas de restricción,
las mismas enzimas que se utilizaron para
cortar el ADN que se quiere insertar.
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Unir el vector y el
ADN que se va a clonar mediante los llamados
extremos cohesivos,
o pegajosos, o escalonados.
Una vez que el ADN
ha sido introducido en el vector se denomina
ADN inserto,
o simplemente, inserto.
Los tipos de
vectores que se utilizan suelen ser plásmidos,
virus como el fago l,
cromosomas creados de forma artificial y
quimeras.
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Formación del ADN recombinante
En esta etapa se
produce la unión covalente del vector y el ADN
inserto mediante una ligasa. Así se realiza el
sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.
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Introducción del ADN recombinante en la célula
anfitriona
Para la clonación
(replicación del ADN recombinante) se necesita la
maquinaria celular. Por ello, hay que introducir
el ADN recombinante en una
célula anfitriona.
Los tipos de
células anfitrionas son:
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Células bacterianas:
son las más utilizadas, ya que tienen una alta
velocidad de replicación, un bajo coste de
mantenimiento de las colonias y son fácilmente
manipulables.
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Células eucariotas:
aunque las células eucariotas son, en general,
difíciles de mantener se usan levaduras y células
tumorales:
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Levaduras: se
utilizan en procesos relacionados con la
investigación de la expresión y la regulación
génica y la síntesis de proteínas eucariotas.
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Células tumorales:
apropiadas en procesos de clonación, ya que la
velocidad de replicación es muy alta y se
mantienen los caracteres sin producirse cambios,
pues son muy estables.
Los métodos para la
introducción del ADN recombinante facilitan la
entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que
la membrana celular es selectiva y no permite la
penetración de grandes moléculas.
Si deseas aprender
más sobre los métodos utilizados para la
introducción del ADN recombinate, pulsa sobre el
siguiente enlace de ampliación.
Ampliación sobre los métodos de introducción de
ADN recombinante
¡Cuando hayas
estudiado la página de ampliación de contenidos
puedes repasar con ayuda de la actividad 4!
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Propagación del cultivo
Se induce la
división de células anfitrionas, de forma que se
producen también copias de ADN recombinante y, por
ello, la clonación. Primero se efectúa una siembra
en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se
dejan crecer las colonias. Cada una de ellas será
seleccionada y transferida a distintos medios
líquidos, donde seguirá aumentando el número de
individuos de la colonia.
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Detección y selección de los clones recombinantes
En los procesos de
clonación se utiliza un gran número de células. Al
final del proceso se hace necesario separar las
células que contienen ADN recombinante de las que
no lo contienen .
La detección y la
selección de colonias se realiza en los medios de
cultivo. En los procesos de clonación se obtienen
células anfitrionas que no han incluido el vector,
células recombinantes, es decir, que han incluido
el vector con el ADN para recombinar y células
anfitrionas con vector que no lleva el ADN
inserto.
Los métodos para
detectar y seleccionar son:
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Método de hibridación:
se utiliza una sonda marcada que hibrida con el
ADN recombinante o con el ARN mensajero que se
transcribe a partir de él.
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Método inmunológico:
se detecta la proteína codificada en el ADN
recombinante mediante anticuerpos específicoos.
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Métodos genéticos:
que, a su vez, pueden ser:
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Inserción del
vector y el ADN recombinante en un gen de la
célula anfitriona que queda desactivado. Por
ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa,
es que el ADN recombinante se encuentra dentro del
ADN bacteriano en ese gen.
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Vector con genes de
resistencia a un antibiótico: en el medio se
agrega el antibiótico y sólo crecerá aquella
colonia que sea resistente a él, por tanto, que
porte el ADN.
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Colonias con
defectos nutricionales: se utilizan células
anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por
ejemplo, un aminoácido. Para que la colonia
sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio
de cultivo. Empleando un vector que lleve el gen
correcto para la síntesis de dicho aminoácido,
haciendo crecer las colonias celulares en medios
carentes de él sólo crecerán las bacterias que
lleven el ADN inserto.
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